近日，「德睿智药」与厦门大学团队合作论文“The binding mechanism of failed, in processing and succeed inhibitors target SARS-CoV-2 main protease”，发表在国际结构生物学顶级期刊Journal of Biomolecular Structure and Dynamics上。基于「德睿智药」Molecule Dance计算平台的Motion Based Drug Discovery模块，研究团队对SARS-CoV-2主蛋白酶（SCM）与五种常见新冠抑制剂的相互作用进行比较分析，揭示了不同抑制剂在相关结合位点上的高度灵活且独特的动态结合方式，该项研究首次发现共价和非共价抑制剂与SCM之间微观尺度下的结合亲和力存在显著差异。
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该研究使用「德睿智药」Molecule Dance技术平台，其主要功能为蛋白质结构预测，以及微观尺度下的蛋白动态模拟。该平台集成「德睿智药」自研同源模建蛋白结构预测模块以及AlphaFold2等公开模块，同时包含多个计算机辅助药物研发AI化工具，例如「德睿智药」首创开发的基于蛋白质动态信息的AI预训练模型ProtMD，可大幅提高药物亲和力预测与虚拟筛选效率。Molecule Dance平台已成功支持「德睿智药」十数个难成药靶点新药研发项目快速推进。
以下为研究背景、数据来源与方法、实验结果与结论：
1. 研究背景
19世纪Fischer提出的锁钥学说认为，蛋白和小分子在结合过程中是刚体，并不会发生任何形变；而当今的生物学家早已放弃这一论断，他们发现蛋白不仅会有形变，而且有随机的抖动和跳跃。1965年诺贝尔物理学奖的获得者理查德·费恩曼（Richard Feynman），曾做过一个很有名的论述：“如果一定要给一个最重要的假设，来帮助科学家们理解生命，那就是万物皆由原子构成，一切生命体可以理解成原子的跳跃和抖动。”在他眼里，根据第一性原理，原子的运动是生命的起点。过去五十年的生物物理学都在致力于更好地理解原子运动的机理。
过去，科学家通过计算机模拟药物分子和靶点蛋白的相互作用，筛选出高靶点亲和力的药物分子，然而由于靶点蛋白的三维构象在不同生理环境下具有一定的随机性，因此直接使用靶点蛋白质的静态结构与分子对接，可能导致预测结果的严重偏差。
现在，DeepMind研发的AI方法AlphaFold2，能够准确预测蛋白质的三维结构，对结构生物学、药物设计、乃至整个科学界都产生了巨大影响。但AlphaFold2只能预测蛋白质在一个瞬间的静态结构，尚未能解决蛋白质结构动态变化的预测。
然而，预测蛋白质结构的动态变化，对理解生命过程、研发新型药物都有着重要的意义。尤其在AI药物设计中，通过对药物分子与靶点蛋白结合后的动态结构变化的预测，评估药物-靶点结合亲和力和药物效果，是提高AI药物筛选准确性和效能的重要思路。
据此，研究团队以SARS-CoV-2主蛋白酶（SCM）及其抑制剂为案例，开展了此项研究。既往该类型药物研究只提供了静态的结合模式，并未能捕捉到SCM与抑制剂之间相互作用的动态模拟。研究团队对五种SCM复合物进行了研究，包括目前已停止临床研发的抑制剂Ritonavir（SCM/RTV）和Lopinavir（SCM/LPV），在研抑制剂N3（SCM/N3），以及已批准的抑制剂Ensitrelvir（SCM/ESV）和Nirmatrelvir（SCM/NMV）。
2. 数据来源与方法
SCM与共价/非共价抑制剂（PDB：6LU7, 7VH8, 7VU6）的共晶体结构来自PDB数据库。研究人员首先使用特定的蛋白质制备模块，对蛋白进行加氢、丢失侧链的补齐、分配氢键、去除水分子以及限制性最小化这些晶体结构，使用非共价对接、非共价对接以及Cross-Docking技术对SCM/LPV、SCM/RTV、SCM/N3、SCM/ESV、SCM/NMV进行了比较。为了进一步研究SCM与这五种抑制剂之间的相互作用，研究人员使用多个专门的分子动力学模块分别进行了5次分子动力学模拟的平行实验。最后，研究人员通过计算各个蛋白体系5次分子动力学轨迹平行实验的MM/PBSA与MM/GBSA平均值，以评估SCM-抑制剂复合物内的结合自由能，用于评估蛋白质-小分子之间的结合情况。
3. 实验结果
3.1 分子对接
表1. 五种抑制剂与SCM的对接结果（kcal/mol）
分子对接结果显示，所使用的对接方案再现了与天然配体非常相似的配体姿态，表现出足够的鲁棒性。五种抑制剂与SCM不同晶体结构的对接得分各不相同。共价/非共价的RMSD值也是评估共价键形成可能性的一个有用指标，较小的共价/非共价RMSD值表明共价键形成更容易。
图1. 五种抑制剂与SCM的三维/二维结合模式
接下来，研究人员对五种抑制剂与SCM的三维和二维结合模式进行了分析。除了LPV和RTV之外，所有SCM抑制剂都能与活性结合位点的残基E166形成至少两个氢键或盐桥相互作用。N3和NMV能够与SCM结合口袋中的关键残基C145形成共价键，并与残基HIE163形成氢键。在非共价抑制剂中，SCM/ESV、SCM/LPV和SCM/RTV复合物中分别形成了4个、1个和2个氢键。此外，ESV、LPV和RTV还能与具有催化活性的重要残基H41形成π-π堆叠相互作用。同时，共价抑制剂N3和NMV分别与SCM形成了7个和6个氢键。这项研究表明，与LPV和RTV相比，N3、NMV和ESV具有更好的结合亲和力，这与对接得分（7VH8和7VU6）的趋势一致。
3.2 SCM的动态特性
图2. 复合物的RMSD和自由能动力轨迹的相关性
由于分子对接研究仅考虑了静态受体结构，为了捕捉潜在的动态信息并确定每种抑制剂最稳定的结合模式，研究人员进一步进行了分子动力学模拟。研究人员分别使用OPLS3e力场与AMBER力场（GAFF2/FF19SB）对这5种SCM/抑制剂复合物对接构象平行进行了5次（共10次）100ns的分子动力学模拟，以比较在不同力场下抑制剂分子的运动趋势与结合模式的变化。
相对而言OPLS3e分子力场在探索全局最优方面表现有较好的性能。其中RTV在非共价对接的分子动力学模拟过程中表现出极不稳定的特征，在5次OPLS3e力场平行模拟中有3次观察到在第30ns左右之后脱离口袋，RMSD最终超过20Å 表明RTV与SCM不能稳定的结合，提示其很可能并不是SCM的抑制剂；同时N3与NMV两种共价抑制剂，在OPLS3e力场下的动力学模拟20ns之后也表现出不太稳定的特征，不过并未完全脱离口袋，RMSD最终超过8埃并且与晶体结构的结合模式相去甚远，说明在OPLS3e力场下共价抑制剂并不能保持非共价结合模式，而AMBER力场在这种情况则要稳定得多。两种力场的模拟中绿色线条表示结合能的波动趋势。总的来说，SCM/ESV系统在两种力场中表现出显著的稳定性，而SCM/RTV系统则表现出不稳定的趋势，提示其并非SCM的抑制剂。
图3. 通过RMSF值计算的每个残基的灵活性
由于平均根均方偏差（RMSD）只能提供构象变化的总体概述，研究人员计算了每个残基的根均方偏差（RMSF）值，以评估单个残基在SCM构象变化中的贡献。五个显著的峰值展示了五种不同抑制剂结合后引起的主要残基构象变化，这些残基主要位于SCM底物结合位点的环状区域。蛋白酶结合位点的柔性环状区域对于识别不同的底物非常关键。因此，开发具有高结合亲和力的抑制剂来稳定环状区域的残基构象可能有助于阻止SARS-CoV-2在细胞内的复制。
3.3 互动分析
图4. 在100ns分子动力学模拟期间的SCM/抑制剂相互作用
在100ns的模拟中，研究人员对蛋白质和配体之间的接触情况进行了分析。首先，我们在全原子水平上分析了SCM与五种抑制剂之间的氢键相互作用。结果显示，与LPV、ESV和RTV相比，N3和NMV与SCM之间的氢键相互作用更多。特别是SCM与NMV的相互作用中，氢键的数量更多，表明抑制剂NMV与SCM的结合力较强。其次，水桥相互作用也被认为是蛋白质-配体复合物稳定性的关键因素。一般而言，水桥相互作用的数量越多，复合物的稳定性越高。研究结果显示，SCM与抑制剂之间的水桥相互作用排序为N3＞NMV＞RTV＞LPV＞ESV，从高到低依次排列。
表2. 使用MM-GBSA和MM-PBSA计算所选SCM/抑制剂复合物的结合自由能的能量成分（kcal/mol）
在模拟的前20ns内，N3、NMV等抑制剂与蛋白质复合物的结合非常稳定。然而，随着时间的推移，共价结合的构象发生了显著变化，只有SCM/ESV复合物保持了稳定的结合状态，其余复合物之间的结合能差异不明显。研究人员还关注了能量成分之间微妙的相互作用，特别是离子相互作用在ESV结合中的重要性。尽管非共价动力学模拟不能完全解释共价抑制剂的行为，但对于进一步理解抑制剂的动态行为具有一定帮助。
图5. 提议的抑制机制-两类共价抑制剂对SCM的作用方式
由于N3和NMV在共价对接方面表现出色，研究人员采用QM/MM和伞形采样模拟，对这两种抑制剂与SCM蛋白质的共价键结合机制进行了详细研究。研究结果显示，这两种抑制剂的共价结合过程都包括两个步骤的反应，并具有不同的反应自由能垒。尽管N3能够形成比NMV更稳定的共价产物状态，但NMV的抑制效果更为显著，因为它具有更低的反应自由能垒。这意味着在抑制SCM的过程中，NMV具有更大的优势。
图6. 使用PM3/MM计算的抑制机制中，N3和NMV两种共价抑制剂的自由能剖面
4. 结论
本研究探索了不同抑制剂与SARS-CoV-2主蛋白酶（SCM）的结合特性。静态研究结果显示，原始晶体抑制剂N3表现出最强的结合亲和力，而NMV、ESV、RTV和LPV也具有较强的结合能力。在此基础上，研究人员通过分子动力学模拟、结合自由能计算和QM/MM方法进一步探索了SCM与抑制剂相互作用的动态过程。研究结果表明，ESV的构象变化最小，而NMV则依靠水桥来稳定结合。此外，NMV的共价加成能力较N3较低，但其结合亲和力可能优于或与N3相当。考虑到其较小的分子量，NMV和ESV可以作为SCM抑制剂的模板或分子优化的起点。