近日，「德睿智药」与北京大学的合作论文“Discovery of 2,4-diarylaminopyrimidine derivatives bearing sulfonamide moiety as novel FAK inhibitors”，发表在生物有机化学高水平期刊Bioorganic Chemistry（JCR分区：Q1）上。研究团队在「德睿智药」Molecule Dance计算平台支持下，深入研究了多个全新化合物和阳性对照药TAE226与黏着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK）的结合模式，为系统理解构效关系，进而设计新型潜在同类最优FAK抑制剂打下理论基础。
[ 技术平台 ]
该研究使用「德睿智药」Molecule Dance技术平台，其主要功能为蛋白质结构预测，以及微观尺度下的蛋白动态模拟。该平台集成「德睿智药」自研同源模建蛋白结构预测模块以及AlphaFold2等公开模块，同时包含多个自研计算机辅助药物研发AI化工具，例如「德睿智药」首创开发的基于蛋白质动态信息的AI预训练模型ProtMD，可大幅提高药物亲和力预测与虚拟筛选效率。Molecule Dance平台已成功支持「德睿智药」十数个难成药靶点新药研发项目快速推进。
以下为研究概况、数据来源与方法、实验结果与结论：
1. 研究概况
Focal adhesion kinase（FAK）作为一种非受体蛋白酪氨酸激酶，在多个信号通路的交汇点发挥关键作用。它能够被多种因子激活，包括整合素、生长因子受体、G蛋白偶联受体等。研究表明，除了在细胞质中参与信号传导外，FAK还在细胞核中发挥重要作用，通过泛素化促进p53降解，从而促进癌细胞的增殖。在肿瘤微环境中，核内的FAK还能够调节新血管形成，影响肿瘤的血液供应。
FAK在人体广泛表达，参与细胞的生长、增殖、迁移和粘附等重要生物过程。在多种人类癌症中发现了FAK的过表达，包括结肠癌、肺癌、乳腺癌等，且过表达与患者预后密切相关。
基于对FAK的研究，科学家认为其是一种具有潜力的抗肿瘤药物靶点。尽管已有一些FAK抑制剂进入临床前和临床试验阶段，但迄今为止还没有批准上市的FAK抑制剂。
在对FAK抑制剂的设计和合成研究中，通过采用分子对接的方法对化合物进行结构优化，取得了显著的成果。对比文献报道的一系列磺酰胺取代的嘧啶衍生物，发现其中的化合物1（Ma, 2017）在与FAK激酶的相互作用方面效果相对较弱。分析发现，该化合物中对嘧啶骨架的C-2苯胺侧链引入了疏水苯环，占据了亲水区域，对FAK活性产生不利影响。为此，研究团队设想在保留磺酰胺基团的同时，在嘧啶的C-2苯胺侧链引入亲水的氨基基团，以提高抗FAK活性（图1）。基于这一设想，设计并合成了一系列磺酰胺取代的2,4-二芳基氨基嘧啶衍生物，最终发现了具有强大FAK抑制活性和抗肿瘤活性的化合物7b。
2. 数据来源与方法
研究基于上述方案对含有氨乙基磺酰胺基团的2,4-二芳基氨基嘧啶衍生物（7a-7o）进行合成。FAK的共晶结构来自PDB数据库（PDB：2JKK）。研究人员首先对蛋白进行了处理，包括加氢、丢失侧链的补齐、分配氢键、去除水分子以及限制性最小化等步骤。随后，采用半柔性对接模块比较了FAK/7b、FAK/1和FAK/TAE226的结合模式。为深入研究动态相互作用，研究采用了全原子力场（OPLS4）和增强采样方法进行了分子动力学模拟，并通过轨迹分析模块对每一帧的蛋白-配体相互作用和结合自由能进行了分析。
3. 实验结果
分子对接
为了明确分子设计原理，研究团队利用分子对接模块，以阳性化合物TAE226为参照，分析了化合物7b或化合物1与FAK的结合模式（图2）。
研究团队观察到了有助于TAE226与FAK结合的关键相互作用，包括嘧啶环的N-1原子和2-氨基与Cys502的疏水侧链形成的氢键，以及TAE226的苯甲酰胺基团与Asp564之间的氢键相互作用。此外，嘧啶环的氯原子与Asp564之间形成的卤键增强了整体结合稳定性。与TAE226相似，化合物7b和化合物1也表现出与关键残基Cys502和Asp564相互作用的结合模式。值得注意的是，化合物7b中咪唑啉基团的质子化氮原子与FAK的Glu506之间形成的氢键和盐桥为结合复合物提供了额外的稳定性。因此，与化合物1和TAE226相比，化合物7b在结合口袋内采用了更稳定的结合模式，显示出更强的结合作用。在对共结晶复合物的蛋白表面进行分析后，研究团队发现化合物7b的结构边缘超出了对接口袋，进入了亲水区域，而化合物1仅停留在附近的疏水区域，TAE226则仅达到溶剂区域。然而，尽管化合物7b的结合亲和力为-8.455 kcal/mol相对较低，但这种结果在半柔性对接中是常见的。
分子动力学模拟
由于受体晶体对接构象分析在揭示配体与受体间相互匹配时容易出现假阳性或假阴性结果，因此采用分子动力学（MD）模拟显得尤为必要。团队使用OPLS4力场和增强采样模式进行了100ns的模拟，分别研究了FAK/7b、FAK/1和FAK/TAE226体系（图3）。
通过对动态模拟期间的交互持久性进行轨迹分析，观察到TAE226在整个模拟过程中表现出稳定的结合模式，结合能达到-68.73 kcal/mol。具体来说，通过研究小分子抑制剂与FAK的相互作用，发现化合物1的苯磺酰胺基团由于与Glu506缺乏稳定氢键相互作用，导致持续波动，结合自由能为-66.45 kcal/mol。而化合物7b则初期波动，但随后形成并保持稳定的氢键，与TAE226相比多了一个氢键，结合自由能更高，为-72.11 kcal/mol。总体而言，全面的分子对接研究和分子动力学模拟为TAE226和化合物7b与FAK蛋白的结合相互作用提供了有价值的见解，这些发现对于理解结构活性关系，并设计新型FAK抑制剂具有重要意义。
生物活性结果
以TAE226为阳性对照，研究对化合物7a-7o的生物活性进行了综合评估，发现它们在FAK激酶抑制（表1）、癌细胞增殖、克隆形成、细胞迁移、细胞周期和诱导凋亡等方面展现出显著的活性。化合物7b在FAK激酶抑制方面表现出最强效果，且在细胞克隆形成实验中显示出比TAE226更显著的生长抑制作用。此外，对HCT-116的细胞迁移实验（图4）表明，化合物7b对细胞迁移的抑制效果显著强于TAE226。细胞周期实验（图5）结果表明，在2μM的浓度下，7b会引起G2/M期细胞数量显著增加，而TAE226并没有产生这种效果。细胞凋亡实验和ROS测定进一步证实了7b相对于TAE226的更强凋亡诱导能力和对ROS的更显著效应。
4. 结论
本研究合成并评估了一系列含有磺酰胺基团的2,4-二芳基氨基嘧啶衍生物，旨在探讨其体外抗FAK激酶活性和抗增殖活性。在这些化合物中，三个特定的分子（7b、7c和7o）表现出卓越的抗肿瘤活性，其中最有效的化合物7b显示出较TAE226更好的激酶活性（IC50=0.27nM）、更高的选择性（SI>14)，且与FAK结合口袋结合的更紧密。此外，化合物7b还引起了细胞周期G2/M期停滞效应，并通过诱导ROS生成促进细胞凋亡。除抗增殖活性之外，7b也表现出了显著抑制HCT-116细胞的克隆形成和细胞迁移的效果。
综上而言，此项研究借助Molecule Dance计算平台的创新性方法，发现了化合物7b作为新型FAK抑制剂的潜力，可作为先导化合物进一步优化以提高成药性。同时也突显了分子对接和分子动力学模拟在药物研发中的关键作用。
论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2024.107134
参考文献：